三分鐘帶你了解當前最熱的基因編輯技術

三分鐘帶你了解當前最熱的基因編輯技術

　　基因編輯技術指能夠讓人類對目標基因進行“編輯”，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術自問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，技術不斷改進后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。基因編輯是一種遺傳工程技術，針對某個序列已知但功能未知的序列，通過改變生物的遺傳基因，使其特定的基因功能喪失作用，通過研究對生物體造成的影響，進而推測出該基因的生物學功能。本文為你科普基因編輯三大技術：

　　基因敲除

　　進行DNA水平編輯。一般用于構建基因敲除鼠模型。

　　CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9系統作為細菌和古細菌的獲得性免疫系統，通過RNA介導特異性的切割外源遺傳物質，用以對抗入侵的病毒和質粒。使用Cas9切口酶和一對sgRNA，兩個相近的切口造成DNA雙鏈斷裂，誘導細胞發生非同源末端連接修復，造成目的基因的突變。

　　CRISPR/Cas9技術自問世以來，取代“鋅指核酸內切酶（ZFN）”、“類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN），成為科研、醫療等領域的有效工具”.一般通過體外轉錄得到sgRNA與cas9的mRNA，通過注射到原核期受精卵內，移植到假孕母鼠體內獲得基因編輯的小鼠進行基因功能研究。

　　構建方法：

　　確定待敲除基因的靶位點。

　　設計識別靶位點的識別的一對sgRNA。

　　構建可表達sgRNA的Cas9質粒。

　　體外轉錄sgRNA 和Cas9 RNA。

　　將sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵檢測sgRNA活性。

　　將有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder。

　　將Founder自交得到F1代。

　　適用范圍：

　　制備敲除鼠，利用敲除鼠進行基因功能的研究；進行細胞水平敲除基因時，可以選擇慢病毒載體，構建lenticrispr-v2質粒，通過包裝病毒進行細胞水平敲除。

　　基因敲減

　　RNA水平，是指通過降解具有同源序列靶基因的mRNA，達到阻止基因表達的作用。一般用于細胞水平敲減基因。

　　（1）RNA干擾：

　　是siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物RISC。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默，是一種特異性的轉錄后基因沉默。

　　一般合成針對靶基因的siRNA，通過轉染的方法使之進入細胞內，使靶基因沉默。這一方法受轉染效率的影響較大。目前有不少基因的siRNA已經有商業產品，所以使用時買來就可以了，比較方便。

　　適用范圍：

　　一般通過公司合成后，通過轉染細胞進行細胞水平敲減。

　　（2）shRNA：

　　“短發夾RNA”，shRNA包括兩個短反向重復序列，中間由一莖環（loop）序列分隔的，組成發夾結構，由polⅢ啟動子控制。隨后再連上5-6個T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉錄終止子。

　　構建shRNA的病毒表達載體，常用的病毒載體有腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體等，機制與質粒載體相似，利用了病毒感染細胞效率比較高的特點，解決了用質粒載體轉染效率低的缺陷。

　　構建方法：

　　shRNA設計：設計RNA干擾序列是RNAi實驗的關鍵。

　　載體構建：可根據實驗需求選擇慢病毒、腺病毒載體。

　　轉染細胞：常用的方法包括磷酸鈣轉染、脂質體轉染、電穿孔轉染等

　　觀測GFP 熒光和穩定表達細胞系篩選：可用于帶有GFP標簽的質粒載體。

　　檢測RNA 干擾效率：可以在蛋白水平或mRNA水平檢測RNA干擾效率。

　　適用范圍：

　　一般通過構建慢病毒、腺病毒等進行細胞水平敲減。

　　編輯點評

　　在過去幾年中， 以ZFN和TALEN為代表的序列特異性核酸酶技術以其能夠高效率地進行定點基因組編輯， 在基礎研究、基因治療和遺傳改良等方面展示出了巨大的潛力。而CRISPR/Cas9技術自問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，技術不斷改進后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

（原標題：基因編輯那么熱，可是你都會用了嗎？）

（來源：解螺旋）

文章鏈接：中國化工儀器網 http://www.chem17.com/news/detail/110946.html